浸沒(méi)培養后孢子形成條件對萎縮芽孢桿菌孢子抗H2O2 滅活能力的影響

在食品和制藥行業(yè)，生產(chǎn)和包裝中的無(wú)菌性在許多情況下極為重要。芽孢由于其高抵抗力，可以在巴氏滅菌和不充分的滅菌過(guò)程中存活下來(lái)，然后發(fā)芽，從而污染裝入非無(wú)菌容器中的無(wú)菌產(chǎn)品。因此，生產(chǎn)設施的無(wú)菌性和無(wú)菌生產(chǎn)的所有滅菌方法均經(jīng)過(guò)初步驗證，定期使用所謂的生物指標（BI）進(jìn)行測試。這些生物指示測試菌，對相應的滅菌過(guò)程具有明確的抵抗力。但對某些滅活方法（例如使用 H₂O₂）具有很高的抵抗力，而且市售BI的抵抗力差異很大。為此推薦本篇文章與大家一起學(xué)習，希望能對大家有所幫助。

內容

1.摘要

孢子的抗性形成，尤其是萎縮芽孢桿菌的抗性形成，長(cháng)期以來(lái)一直是生物防御、制藥和食品工業(yè)科學(xué)研究的重點(diǎn)。在食品工業(yè)中，它被用作生物指示劑 (BI)，用于評估過(guò)氧化氫在加工和最終包裝線(xiàn)滅菌中的滅活效果。盡管用作生物指示劑的孢子已經(jīng)生產(chǎn)多年，但人們對孢子形成條件對抗性的影響知之甚少，而孢子形成條件是隨機變異的潛在來(lái)源。因此，本研究考察了在生物反應器中浸沒(méi)生產(chǎn)過(guò)程中孢子抗性對溫度、pH 值和部分氧飽和度的依賴(lài)性。為此，在不同的孢子形成條件下生產(chǎn)孢子，并使用35%液態(tài)過(guò)氧化氫中的計數減少測試確定它們的抗性（由D值定義）。測試結果的統計分析表明，抗性與pH值呈二次依賴(lài)關(guān)系，中性pH下的D值最高。孢子形成溫度對抗性具有線(xiàn)性影響，溫度越高，D值越高。但是，這些因素相互作用，這意味著(zhù)當pH值在一定范圍內時(shí)，溫度才會(huì )影響抗性。孢子形成過(guò)程中的氧飽和度沒(méi)有顯著(zhù)影響。根據獲得的數據，可以開(kāi)發(fā)一個(gè)模型，根據孢子形成條件來(lái)計算、預測和標準化BI的抗性。為此，BI制造商可以生產(chǎn)具有明確抗性的BI，以驗證無(wú)菌包裝/灌裝線(xiàn)中的滅菌效果，從而可靠地生產(chǎn)保質(zhì)期長(cháng)且安全的食品。

2.結果與討論

為了能夠研究孢子形成條件（pH、溫度、培養基中的氧飽和度）對孢子抗性的影響，開(kāi)發(fā)了全因子實(shí)驗設計（DoE）。通過(guò)因子測試計劃，可以檢查多個(gè)因素對一個(gè)（或多個(gè)）目標變量的影響。本研究中的影響變量為溫度、pH 值和培養基的氧飽和度。對于有 2-3 個(gè)影響因素的情況，通常采用兩階段測試計劃，即每個(gè)影響變量都在兩個(gè)層面上進(jìn)行檢驗（最小值和最大值）。

為了進(jìn)行建模，在生物反應器中進(jìn)行了初步測試以確定極值。極值設置為pH 6.0和8.5，中心點(diǎn)為7.25；對于溫度，它們被設置為 28 ℃ 和 40 ℃，中心點(diǎn)為 34℃；對于最低氧飽和度，它們被設置為10%、60% 和 35%。根據這個(gè)值范圍確定實(shí)驗計劃，并在指定的孢子形成條件下在生物反應器中產(chǎn)生孢子。收獲并純化產(chǎn)生的孢子后，以 25 ℃下對35%液態(tài)過(guò)氧化氫的D值來(lái)確定孢子的抗性。

表1顯示了具有孢子形成條件的全因子實(shí)驗設計以及由此產(chǎn)生的測量和計算的D值?？梢钥闯?，測試系列的測量D值與調整后的模型的計算D值非常匹配。實(shí)驗編號9是一個(gè)例外，這就是為什么它沒(méi)有被包括在計算中。

       16次測試系列的測量D值在40到197秒之間，與模型計算出的D值非常吻合。這可以通過(guò)在圖1中繪制測量的D值與計算出的D值來(lái)證實(shí)，r² 值為 0.93。模型對齊還表明，培養基中的氧飽和度對D值沒(méi)有顯著(zhù)影響。

因此，在進(jìn)一步的模型計算中不考慮氧飽和度。

    根據D值，該模型得出一個(gè)方程（方程1），通過(guò)該方程可以預測模型范圍內的所有D值（如在極端情況下的影響因素溫度和pH值）。

利用該方程可以建立D值對溫度和pH值影響的三維預測模型（圖2）。

在pH為6.9和溫度為40℃時(shí)，D值最高，為 200 s。預期D值會(huì )隨著(zhù)pH值的酸堿變化而下降。根據所選的pH值，溫度對D值的影響也不同。在pH值較低（例如6.0）時(shí)，D值對溫度呈現出非常強的線(xiàn)性依賴(lài)性，這意味著(zhù)隨著(zhù)溫度的升高，D 值也會(huì )增加。在pH 值為8.5時(shí)，升高溫度不會(huì )增加D值。這兩個(gè)影響變量之間的相互作用在圖3中變得明顯。

隨著(zhù)pH值的增加，溫度的影響逐漸減小，溫度對D值的最大影響是在pH值6.0的微酸性條件下，當pH達到7.0 時(shí)，溫度對D值的影響會(huì )減弱，但仍然很大。從pH值7.8到8.5，溫度對D值不再有顯著(zhù)影響。此外，pH對D值的影響也會(huì )根據溫度而變化。在28℃ 時(shí)，預期 pH 值為7.2時(shí)D值最高。在40℃時(shí)，預期pH 值為6.9 時(shí)D值最高。這意味著(zhù)預期最大D值的pH值會(huì )隨著(zhù)溫度升高而變化。

本研究表明，浸沒(méi)式生產(chǎn)的孢子對過(guò)氧化氫的抗性在很大程度上取決于 pH 值和溫度。pH 值對抗性有二次影響，這意味著(zhù)存在一個(gè)最佳值，在該最佳值下抗性達到最大值。如果 pH 值進(jìn)一步變?yōu)樗嵝曰驂A性，孢子的抗性也會(huì )降低。然而，抗性對溫度呈線(xiàn)性依賴(lài)性。隨著(zhù)溫度升高，孢子對過(guò)氧化氫的抗性也會(huì )增加。應該注意的是，pH值和溫度之間存在相互作用，這意味著(zhù)這些因素相互影響。在pH值中性和酸性范圍內，溫度的影響最強。當pH值變得更堿性時(shí)，溫度的影響會(huì )降低，直到溫度最終對抵抗力沒(méi)有影響。培養基的氧飽和度對孢子的抗性沒(méi)有顯著(zhù)影響。

本研究未研究溫度和pH值與培養基或其成分（主要成分、濃度和錳、鐵、鋅、鈣等的存在）之間是否存在相互作用以及相互作用的程度，以及這是否會(huì )影響孢子對過(guò)氧化氫的抗性。孢子抗性的形成受到許多因素的影響，這些因素相互交織、相互影響或相互依賴(lài)。因此，未來(lái)不應再單獨或僅以最謹慎的態(tài)度來(lái)研究這些影響因素。