洋蔥伯克霍爾德氏菌復合體（BCC）能夠在低營(yíng)養環(huán)境和惡劣條件下保持存活，對非無(wú)菌藥品構成污染風(fēng)險，且難以檢測。BCC分離株是污染無(wú)菌和非無(wú)菌藥品的一些最常見(jiàn)的微生物，最近爆發(fā)的幾次感染與被發(fā)現的含有BCC的防腐劑有關(guān)。含水產(chǎn)品尤其危險，因為BCC能夠在惡劣條件下保持活力，包括防腐劑的存在。本研究的目的是評估使用寡營(yíng)養培養基的BCC，與使用TSA或TSB在不同的無(wú)菌蒸餾水樣品中保存溫度以及不同的防腐劑濃度下的恢復情況，并進(jìn)行比較。因此推薦這篇文章給大家，希望能對大家有所幫助。

Oligotrophic Media Compared with a Tryptic Soy Agar or Broth for the Recovery of Burkholderia cepacia Complex from Different Storage Temperatures and Culture Conditions

內容

摘要：洋蔥伯克霍爾德氏菌菌群（BCC）能夠在低營(yíng)養環(huán)境和惡劣條件下保持存活，對非無(wú)菌藥品構成污染風(fēng)險，并對檢測構成挑戰。為了建立檢測BCC的最佳回收方法，我們對三種寡營(yíng)養培養基進(jìn)行了評價(jià)，并用營(yíng)養培養基從高壓蒸餾水或防腐溶液中回收BCC進(jìn)行了比較。將20株BCC菌株連續稀釋后（10^-1~10^-12 CFU/ml）接種到高壓蒸餾水中，在6℃、23℃和42℃條件下保存42天。用6種洋蔥伯克霍爾德氏菌懸液接種含5 μg/ml和50 μg/ml氯己定葡萄糖酸酯（CHX）和10 μg/ml苯扎氯銨（BZK）的水溶液，并在23℃再儲存199天。營(yíng)養培養基，如胰蛋白酶大豆瓊脂（TSA）或胰蛋白酶大豆肉湯（TSB），少營(yíng)養培養基(1/10強度的TSA或TSB，R2A或R2AB，和1/3強度R2A或R2AB，使用這些培養基接種從高壓蒸餾水和防腐樣品的BCC。液體培養基中BCC（水中或防腐劑中）的回收率高于固體培養基。寡營(yíng)養培養基對20株BCC樣品的回收效率高于TSA或TSB。多重比較的結果使我們能夠直接識別TSA或TSB與寡營(yíng)養培養基之間的顯著(zhù)差異。美國藥典（USP）提出的BCC檢測的簡(jiǎn)單檢測方法提供了一種寡營(yíng)養培養基預富集復蘇步驟。

材料和方法：

寡培養基的制備：

結果：

不同儲存溫度下TSB和R2AB的生長(cháng)動(dòng)力學(xué)：為了了解溫度對存活的影響，將20株BCC在3種溫度（6℃、23℃和42℃）下保存42天，并在不同的培養基中恢復。綜合結果，在6℃、23℃和42℃下觀(guān)察到存活，沒(méi)有發(fā)現物種特異性的趨勢。當培養基接種初始濃度為10²-10⁰ CFU/ml（在蒸餾水6℃和23℃保存42天），10⁸-10⁶ CFU/ml（在蒸餾水42°C保存42天時(shí)），觀(guān)察到洋蔥AU19236的生長(cháng)。在TSB、1/10×TSB、R2AB和1/3×R2AB中觀(guān)察了AU19236在30℃培養24 h后的生長(cháng)，并使用Baranyi模型描述了動(dòng)力學(xué)。接種TSB、1/10×TSB、R2AB和1/3×R2AB的AU19236擬合的生長(cháng)曲線(xiàn)平均r²值為> 0.98。由于回歸線(xiàn)與觀(guān)測數據點(diǎn)近似，因此在平均生長(cháng)曲線(xiàn)中得到了較高的r²值。在6℃保存的蒸餾水中培養，顯示出更長(cháng)的滯后時(shí)間（λ），范圍在17.6-27.4h之間（圖1A）。在23℃和42℃（分別為10.1和14.2h）下估計的滯后時(shí)間沒(méi)有顯著(zhù)差異（1B和1C）。在6℃和23℃時(shí)，1/10×TSB、R2AB和1/3×R2AB的滯后時(shí)間值（λ）大于TSB，但在42℃時(shí)，滯后時(shí)間值不大。此外，無(wú)論使用何種培養基生長(cháng)速度(μ)沒(méi)有顯著(zhù)差異（p > 0.05），盡管寡營(yíng)養的生長(cháng)培養基（如1/10×TSB,R2AB和1/3×R2AB在23℃和42℃）增長(cháng)率更大。

不同儲存溫度下TSA與寡營(yíng)養固體培養基比較：為了評估固體培養基中的活菌落計數，使用ProtoCOL3自動(dòng)平板計數器對每個(gè)平板進(jìn)行計數。

經(jīng)過(guò)42天的培養，在6°C（10⁴-10⁸ CFU/ml）和23°C（10⁷-10¹² CFU/ml）的濃度下，所有的瓊脂都很容易恢復。然而，在42°C（10²-10⁶ CFU/ml）的蒸餾水中當20株BCC菌株被接種在固體培養基上時(shí)，只有8株BCC菌株42天后生長(cháng)。其余菌株培養9天后沒(méi)有在固體培養基上生長(cháng)。

在6°C儲存42天后，所有瓊脂的回收率約為10⁴ -10⁸ CFU/ml。B. lata HI4002，B. cenocepacia HI2976 和 B. cenocepacia HI2485 為BCC菌株，菌落計數較高，達到10⁸ CFU/ml。1/3×R2A（1.79 ± 6.81×10⁸ CFU/ml）和R2A（1.95 ± 7.31×10⁸ CFU/ml）的菌落計數略高于TSA（1.67 ± 6.41×10⁸ CFU/ml）的菌落計數。采用Mann-Whitney Rank Sum Test比較TSA與1/10×TSA、1/3×R2A和R2A之間的差異，差異無(wú)統計學(xué)意義（p < 0.05）。在23°C的蒸餾水中，在各種培養基上，10¹² CFU/ml BCC的初始濃度保持不變。1/10×TSA（4.18 ± 6.17×10¹² CFU/ml）、1/13×R2A（4.17 ± 5.62×10¹² CFU/ml）和R2A（4.46 ± 5.78×10¹² CFU/ml）的菌落計數均高于TSA（3.44 ± 5.09×10¹² CFU/ml）。采用Mann-Whitney Rank Sum Test比較TSA與R2A的差異，發(fā)現差異有統計學(xué)意義（p < 0.041）。

在42°C時(shí)，只有8株菌株生長(cháng)到約10⁵ CFU/ml。1/10×TSA（2.01 ± 4.17×10⁵ CFU/ml）、1/3×R2A（6.56 ± 15.05×10⁵ CFU/ml）和R2A（6.53 ± 14.72×10⁵ CFU/ml）的菌落數量比TSA（0.57±1.39±1.39×10⁵ CFU/ml）更高。采用Mann-Whitney Rank Sum Test比較TSA與寡營(yíng)養培養基的差異，如1/10×TSA（p = 0.008）、1/3×R2A（p < 0.001）和R2A（p < 0.001）。

不同儲存溫度下TSB和寡營(yíng)養肉湯培養基的比較：對TSB、1/10×TSB、1/3×R2AB和R2AB肉湯培養基在6°C、23°C和42°C下恢復BCC的能力進(jìn)行了評估。

     在6°C存儲時(shí)，與1/10×TSB、1/3×R2AB和R2AB相比，TSB介質(zhì)中的回收效率較低，回收率分別為351/480（回收次數/測試次數）、345/480和353/480。對接種的菌落數最低（10^-12）的4個(gè)肉湯的評價(jià)表明，1/10×TSB、1/3×R2AB和R2AB支持從23°C存儲中回收BCC。在480次試驗中，分別有39、94、94、107、79個(gè)TSB、1/10×TSB、1/3×R2AB和R2AB培養基中BCC的回收率存在差異。統計分析顯示，TSB的有效性低于1/10×TSB。

CHX和BZK的恢復

TSA和稀釋固體培養基在不同濃度的防腐劑下的比較：將6株菌株懸浮在5和50 μg/ml CHX或10 μg/ml BZK中。在5和50 μg/ml的CHX溶液中，1/10×TSA（7.06 ± 6.5×10⁴ CFU/ml，3.73 ± 3.93×10³ CFU/ml）的菌落計數略高于TSA（6.59 ± 5.12×10⁴ CFU/ml，3.03 ± 3.42×10³ CFU/ml），分別如下圖：

    采用Mann-Whitney Rank Sum Test比較TSA與1/10×TSA的差異，兩組間差異無(wú)統計學(xué)意義(p < 0.05)。此外，在10 μg/mlBZK溶液中，1/10×TSA（1.51 ± 1.77×103 CFU/ml）、1/3×R2A（1.58 ± 1.73×103 CFU/ml）、R2A（129±2.24×103 CFU/ml）的菌株數量分別略高于TSA（1.27 ± 1.28×103 CFU/ml）。

不同濃度防腐劑下TSB和少營(yíng)養肉湯培養基的比較：對TSB、1/10×TSB、1/3×R2AB和R2AB肉湯培養基在5和50 μg/ml CHX或10 μg/ml BZK中恢復BCC的能力進(jìn)行評價(jià)。在R2AB介質(zhì)中恢復效率更高，恢復數量分別為134/144（恢復次數/試驗次數，從5 μg/ml of CHX）、114/144（50 μg/ml of CHX）和113/144（10 μg/ml of BZK）。

    數據統計分析顯示，TSB和R2AB的CHX的5μg/ml（χ2統計= 6.9231，p = 0.0085）、50 μg/ml的CHX（χ2統計= 9.8223，p = 0.0017）和10 μg/ml的BZK（χ2統計= 31.3481，p < 0.05）之間存在顯著(zhù)差異。

討論：

洋蔥伯克霍爾德氏菌復合體（BCC）能夠在低營(yíng)養環(huán)境和惡劣條件下保持存活，對非無(wú)菌藥品構成污染風(fēng)險，并對檢測構成挑戰。為了建立檢測BCC的最佳回收方法，作者對三種寡營(yíng)養培養基進(jìn)行了評價(jià)，并與營(yíng)養培養基從高壓蒸餾水或防腐溶液中回收BCC進(jìn)行了比較。將20株BCC菌株連續稀釋后（10^-1~10-¹² CFU/ml）接種到高壓蒸餾水中，在6℃、23℃和42℃條件下保存42天。用6種洋蔥伯克霍爾德氏菌懸液接種含5 μg/ml和50 μg/ml氯己定葡萄糖酸酯（CHX）和10 μg/ml苯扎氯銨（BZK）的水溶液，并在23℃再儲存199天。營(yíng)養培養基，如胰蛋白酶大豆瓊脂（TSA）或胰蛋白酶大豆肉湯（TSB），少營(yíng)養培養基(1/10強度的TSA或TSB，R2A或R2AB，和1/3強度R2A或R2AB)通過(guò)接種高壓蒸餾水和防腐樣品的BCC到培養基中。肉湯培養基中水中或防腐劑中BCC的回收率高于固體培養基。寡營(yíng)養培養基對20BCC樣品的回收效率高于TSA或TSB。多重比較的結果使我們能夠直接識別TSA或TSB與寡營(yíng)養培養基之間的顯著(zhù)差異。